Caracterización de secuencias, mapeo in silico y análisis de metilación de secuencias ligadas a la aposporía en Paspalum notatum.

J P Ortiz, M Podio, M P Rodríguez, S Felitti, J Stein, E J Martínez, L A Siena, C L Quarin, S C Pessino

Resumen


En estudios previos informamos la identificación de varios marcadores moleculares de AFLP, RAPD y RFLP completamente ligados al locus que controla la aposporía en Paspalum notatum. El objetivo de este trabajo fue caracterizar las secuencias de estos marcadores, estimar el número de copias de los mismos en el genoma, obtener las regiones flanqueantes de algunos de ellos por medio de estrategias de caminata cromosomal y realizar un análisis de mapeo in silico sobre arroz y maíz. Asimismo, el estado de metilación de dos secuencias asociadas a este locus fue determinado mediante experimentos RFLP utilizando enzimas sensibles a metilación. Como material vegetal se emplearon los genotipos tetraploides de P. notatum Q4188 (sexual), Q4117 (apomíctico) y una población segregante por el modo de reproducción derivada del cruzamiento entre ambos. Los marcadores moleculares de AFLP y RAPD ligados a la apomixis fueron ensayados sobre los genotipos parentales y su progenie a fin de confirmar su cosegración con el carácter aposporía. Las bandas correspondientes a cada uno fueron aisladas a partir del genotipo apomíctico (Q4117) y clonadas en el sistema pGEM-Teasy (Promega) y secuenciadas por Macrogen (Corea). Aproximadamente 5 kb correspondiente a diferentes marcadores fueron caracterizados por este procedimiento. El análisis de 14 secuencias de este tipo reveló que la mayoría de las secuencias no presentó similitudes significativas en la bases de datos. Sólo dos fragmentos correspondieron a ESTs expresados en Panicum virgatum. La estimación del número de copias mostró la presencia de elementos repetitivos como también de copia simple. En particular los fragmentos derivados de los marcadores PnMAC5 y PnMAI3 mostraron 1 y 2-4 copias por genoma, respectivamente. El marcador PnMAC5 resultó monomórfico entre los progenitores de la población de mapeo, mientras que PnMAI3 mostró un fragmento ligado a la aposporía. La extensión de este marcador por caminata cromosomal posibilitó la identificación de secuencias adicionales, una de las cuales correspondió a una proteína del tipo AMT-70. El análisis de mapeo in silico determinó que las secuencias asociadas al locus aposporía en P. notatum se localizan principalmente en los cromosomas 2 y 12 de arroz y 3 y 5 de maíz. Dos loci asociados a la apomixis fueron analizados en experimentos RFLP utilizando enzimas sensibles a metilación. Los resultados experimentales mostraron que ambas secuencias se encuentran metiladas en los genotipos sexuales y apomícticos y no fue posible detectar polimorfismos de metilación asociados con el modo de reproducción.

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